樊　民1,李　岚2,王　皓3,高春芳3,李洪涛1,任雨笙1,吴宗贵1
(1.上海第二军医大学长征医院心内科,上海200003;2.解放军411医院内4科;3.长征医院实验诊断科)
　　高春芳等(2000)前期已经构建了人I型胶原α2(I)链基因启动子重组体并讨论了影响其活性的一些因素。我们选取CAT报告基因活性较高的重组质粒pCOLH22.4和pCOLH21.6为研究对象,研究rhCD40L和阿司匹林对胶原启动子活性的影响。CD40 CD40L在致动脉粥样硬化(AS)炎症反应中起着至关重要的作用,研究发现阿司匹林可以延缓AS进程并对AS斑块的稳定性产生影响。本实验通过研究rhCD40L和阿司匹林对人I型胶原α2(I)链启动子活性的影响,从转录水平上阐明它们对AS进程影响的机制。
1　材料和方法
1.1　材料
　  主要仪器包括超净工作台、倒置相差显微镜、二氧化碳培养箱、离心机、紫外分光光度计等。主要试剂:脂质体转染试剂(Lipofectamine)购自In vitrogen公司,CATELISA试剂盒(Roche公司),rh CD40L(美国R&D公司),阿司匹林(上海九福制药有限公司),限制性内切酶KpnI、NheⅠ(Roche公司),人I型胶原α2(I)链基因启动子重组质粒pCOLH22.4和pCOLH21.6由长征医院实验诊断科高春芳教授提供。
1.2　方法
1.2.1　细胞培养和鉴定
  　组织贴块法行人脐动脉血管平滑肌细胞(VSMC)原代培养[1]。培养液为含100ml/L新生牛血清和100ml/L胎牛血清的DMEM,待细胞长成“峰、谷”交错的致密细胞层,可进行传代培养。取第3～6代VSMC用于实验。VSMC的鉴定:倒置相差显微镜观察活细胞的形态和生长方式;抗α 肌动蛋白免疫细胞化学染色检测鉴定细胞。
1.2.2　质粒pCOLH22.4和pCOLH21.6的转化、扩增与鉴定　常规制备JM109大肠杆菌的感受态细菌并转化pCOLH22.4和pCOLH21.6质粒;质粒pCOLH22.4和pCOLH21.6的扩增与抽提按华舜生物公司小量柱离心式质粒抽提纯化试剂盒操作手册进行;以特异性限制性内切酶行质粒pCOLH22.4和pCOLH21.6酶切鉴定;以分光光度计法定量对所提取的质粒行核酸定量。
1.2.3　质粒pCOLH22.4和pCOLH21.6转染人脐动脉血管平滑肌细胞　采用脂质体介导的基因转染技术,脂质体转染试剂(Lipofectamine,Invitrogen公司),操作同说明书。
1.2.4　细胞转染后干预
　将孔内液体更换为无血清培养基,CO2孵箱静置5h后,在孔内分别加入终浓度为100μmol/L的阿司匹林和0.4mg/L的rh CD40L,并补加血清至20ml/L,继续培养24h后测报告基因CAT活性。
1.2.5　ELISA测定CAT
　参考CATELISAkit(Roche)说明书进行。所有实验重复3次,每次2复孔。以对照组的CAT值为1,实验孔与之比值作为实验孔CAT的相对表达量。
1.3　统计学处理
　数据以 x±s表示,各处理组间比较采用方差分析、SNK法两两比较,P≤0.05为差异具有统计学意义。
2　结果
2.1　VSMC的鉴定
2.1.1　倒置相差显微镜观察活细胞的形态和生长方式　可见VSMC典型的生长方式,细胞呈梭形,平行生长,束状排列,密集与稀疏处相互交错呈“峰谷”状(图1)。
2.1.2　抗肌动蛋白免疫组织化学染色检测　经α 肌动蛋白免疫染色,可见细胞染成棕黄色,染色阳性,证实为VSMC(图2)。
2.2　不同药物作用下转染重组体的细胞报告基因表达水平测定　将pCOLH22.4、pCOLH21.6重组体转染靶细胞24h后,撤血清培养5h,分别加入空白对照、0.4mg/LrhCD40L、100μmol/L阿司匹林培养24h,测得CAT相对表达量,结果示(表1):阿司匹林可以增加pCOLH22.4及pCOLH21.6的CAT的表达(P<0.05),增加Ⅰ型胶原基因启动子活性,在转录水平上诱导Ⅰ型胶原的表达;rhCD40L可以抑制Ⅰ型胶原基因启动子活性,在转录水平上抑制Ⅰ型胶原的表达。
2.3　不同浓度的rhCD40L对转染重组体的细胞报告基因表达水平的影响　将pCOLH22.4、pCOLH21.6重组体转染靶细胞24h后,无血清培养5h,分别加入终浓度0.1、0.2、0.4mg/L的rhCD40L,补血清至20ml/L,培养24h后测得CAT相对表达量结果见表2。结果可知,rhCD40L可以抑制胶原启动子表达,且呈剂量依赖性,0.4mg/L的rhCD40L对启动子活性抑制作用最强,有统计学差异(P<0.05)。

不难看出,与对照组比较,0.4mg/L的rhCD40L可以明显抑制胶原启动子表达增加(P<0.01),而阿司匹林可以逆转此种表达抑制作用(P<0.05)。
3　讨论
   启动子是基因转录起始所必需的一段DNA序列,位于结构基因的上游,是DNA分子上可与RNA聚合酶特异结合而使转录起始的部位。细胞因子对胶原蛋白基因的激活途径包括与细胞膜上的受体结合,通过信号转导系统,激活核转录因子与胶原基因启动子上的顺式作用元件结合,启动胶原mRNA的合成。启动子的激活是信号转导途径的最后一站。本实验针对启动子激活这一环节,在转录水平研究细胞因子及某些药物对胶原蛋白合成的调控。CD40和CD40配体(CD40ligand,CD40L)在AS发生和斑块稳定性中的作用近年来日益引起人们的重视。病理研究发现无论早期,还是晚期复杂AS病变中都有CD40和CD40L的表达,尤其在斑块易破裂的肩部及破裂的斑块中更为显著。除了限制病变的进展外,抗CD40治疗改变了AS斑块的组成,形成了能够促进斑块稳定的形态,如减少了巨噬细胞和脂质的相对含量,并同时增加了平滑肌细胞和胶原的含量。这表明CD40系统不仅作为AS的始动因素,还是影响AS斑块稳定性的一个重要因素。
    以往研究发现CD40 CD40L系统是AS斑块稳定性的一个非常重要的影响因素,也有一些研究发现阿司匹林均有斑块稳定作用,如Cyrus等[4]发现小剂量阿司匹林显著降低炎症因子(包括sICAM 1,MCP 1,TNF α,IL 12p)水平伴动脉壁中NF kB活性降低,降低AS斑块程度,同时斑块中巨噬细胞减少、平滑肌细胞增加、胶原含量增加。Redondo等[5]发现阿司匹林通过抑制TGF β表达从而对细胞增殖产生抑制作用。其他研究发现对冠心病患者,阿司匹林可以降低其CRP水平,高CRP水平的个体接受阿司匹林治疗的效果明显好于低CRP水平的个体;阿司匹林可以抑制肺炎衣原体诱导的NF kB活性增加(Tiran,2002)。
    胶原含量是影响AS斑块稳定性的决定因素之一,虽然CD40系统、COX系统与斑块易损性之间关系的研究不少,但有关它们影响胶原合成的直接证据尚不多见,为此我们进行了相应的研究。Horton等[6]发现离体情况下CD40L完全抑制人血管平滑肌细胞中前胶原表达,但认为这种作用与胶原转录无关而与MMP有关。我们研究发现rhCD40L抑制I型胶原α2(Ⅰ)启动子表达,阿司匹林增加I型胶原α2(Ⅰ)启动子活性,同时可以逆转rhCD40L对I型胶原α2(Ⅰ)启动子活性的抑制作用。阿司匹林上调人I型胶原启动子活性表达,并且逆转rh CD40L对人I型胶原启动子活性的下调作用,可能是其抗AS和稳定斑块的机制之一。