江苏省南京医科大学附属南京第一医院　
王丽　邱海波１　郭凤梅　杨毅，南京　２１０００９
　　胶原合成增加是肺纤维化的主要特征。肺泡炎等导致肺结构变化是肺纤维化的重要原因，肺成纤维细胞离体行机械牵张４犺即有胶原改变［１］，本实验观察了在体大鼠高潮气量所致肺损伤时肺胶原合成的变化，报道如下。
材料与方法
    实验材料健康普通级sD大鼠24只，体重(220士20)kg，雄性，江苏省南京安立默科技有限公司提供。聚合酶链反应(Pc助引物由上海捷倍斯公司合成;酚和异硫氰酸肌混合RNA分离液(T RlzoL)购自Invitrogen公司;I型前胶原肤(Pl NP，procollagentype 1 propepti山)和11型前胶原肤(P 11伽P，proColla-ge n p ropeptide type 11办酶联免疫吸附测定(ELIsA)试剂盒购自Lifekoy公司;逆转录Pc班RT- Pc助试剂盒由美国Promoga公司提供。
    动物分组大鼠随机分为3组:正常对照组、朝气量(vT)5 ml/kg组和vT 16 ml/kg组。3组均腹腔注射戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉，仰卧固定，气管切开，置入直径1.5 mm的气管插管。正常对照组气管切开后马上处死。VT 8 ml/ kg组和16ml/kg组接小动物呼吸机(ve ntilator Asv，HarvardApparatus，Bo9028)，均采用容量控制通气，呼气末正压(PEEP)5 CmHZo(iCmHZo二o.ogskPa)，吸呼比为1:2，吸入氧浓度(FioZ)100%。为保证实验过程中动脉血pH在7 .30一7.47，VT8ml/kg组呼吸频率为50次/min，vT 16 ml/kg组35次/min。机械通气4h后处死。
    肺泡灌洗液与血浆蛋臼测定取心内血约2ml(10川离心管需要肝素润过)，之后放血，打开胸腔，结扎左肺及右肺前后叶支气管，对右肺中叶进行肺泡灌洗，每次用玻璃空针注入冰生理盐水2川，3次，每次注入后保留55，倒置动物后使肺泡灌洗液随重力回到玻璃空针中，计算回收率。肺泡灌洗液用单层无菌纱布过滤后，置于10川离心管中，离心后取上清，测定血浆和肺泡灌洗液蛋白比值，反映肺损伤程度。
    肺水含量测定取大鼠左肺，迅速用吸水纸吸干肺表面水分和血液，称重后(得到湿重)置于80℃烘箱中共72h至恒重，再称重(得到干重)并计算肺组织湿/干重(w/D)，观察肺水肿程度。
    肺组织病理检查取右后叶肺，固定、包埋、切片、HE染色。光镜下观察。
    工型和111型前胶原mRNA检测取组织(约100 mg)加入萃取液(T RlzoL)，充分匀浆，加入氯仿，剧烈振荡15、，将组织匀浆离心(2一8℃，12000g，15 min)，RNA溶于上层水相中。将水相转移到新的试管中，加入异丙醇，离心(2一8℃，120009，10min)，RNA沉于管底。弃去上清液，加入75%乙醇1min，混合振荡，离心(2一8℃，75009，5 min)，弃去上清液，在空气中干燥后加入无核酶水，溶解RNA。测定RNA含量及A260/280比值。调整各样品RNA浓度达到一致。
    按试剂盒要求加入无核酶水、脱氧核普三磷酸(dNTP)、逆转录酶(AMv)、TaqDNA聚合酶、硫酸镁(Mg 5 04)派 actin引物、工型前胶原引物、11型前胶原引物、缓冲液和总RNA，总反应体积50川。进行RT- PcR反应。逆转录48℃x 45 min，预变性94℃x 3 min，变性94℃x 305，退火60℃x 605，延伸72℃x 305，最后延伸72℃x 7 min，根据试剂盒要求共40个循环后中止反应，4℃冷却。将PcR产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，采用3 v/ Cm电压，电泳结束后应用uvP图像分析系统进行灰度扫描，将工型和11型前胶原PcR产物的条带灰度值与卜actin比较，对PcR产物半定量分析。
    PINP和PlllNP检测取大鼠肺组织约100纯，加入1川冰PBs溶液，匀浆后，4℃离心，1500 rPm，10 min，留取上清液，一20℃保存。根据标准曲线在酶标仪上490 nm处测待测标本吸光度值，得到P工NP和PlllNP含量。
    统计学处理采用sPss n .0软件，数据以(x--士s)表示，进行单因素方差分析，多个样本均数两两比较采用。检验，以P<0 .05为差异有统计学意义。
结果
    肺组织w/D及肺泡灌洗液与血浆蛋白比值与对照组肺组织w/D比较，vT 5 ml/kg组和VT16 ml/kg组均显著升高(P均<0 .05);vT 16 ml/kg组显著高于vT 8 ml/ kg组(P<0 .05)。对照组和vT 8 ml/ kg组肺泡灌洗液与血浆蛋白比值无显著差异，而vT 16 ml/ kg组与上述两组间均有显著差异(P<0 .05)，见表1。

讨论
    肺纤维化是影响呼吸衰竭预后的重要因素。本研究发现高潮气量可引起正常大鼠呼吸机相关肺损伤(vILI)，肺组织工型和111型前胶原mRNA表达增加，提示高潮气量所致肺损伤可能会加重肺纤维化。
    本实验表明，正常大鼠机械通气4h后，高潮气量(16 ml/kg)通气大鼠肺组织出现充血水肿、炎症细胞浸润和肺泡出血渗出等肺损伤的表现，且肺组织w/D增加，肺泡灌洗液与血浆蛋白比值增加，与对照组比较有显著改变，提示高潮气量通气引起vILI。该结果与Park。:等的研究相符。其机制可能与潮气量过高引起肺泡过度膨胀、肺泡上皮和毛细血管内皮细胞损伤、炎症细胞激活与移位等有关。
    胶原合成增加是产生肺纤维化的主要因素。本研究显示正常大鼠高潮气量通气4h后工型和111型前胶原mRNA表达显著增强，表明高潮气量可导致肺胶原合成增加。carus。等〔3〕以正常大鼠为研究对象，观察到高潮气量通气11型前胶原 mRNA表达增加，与本研究结果相一致。
    前胶原肤由前胶原裂解产生，是反映胶原合成的敏感指标。swartZ等〔4〕研究显示过度牵张间接刺激肺成纤维细胞4h后，发现成纤维细胞增生，释放胶原蛋白增加。本实验给正常大鼠进行常规和高潮气量通气4h，并未观察到肺组织中P工NP和PIllNP表达显著增强，推测可能与体外和体内实验的胶原合成时间不同有关。本实验观察时间较短，前胶原肤合成滞后于mRNA表达，这可能是本实验
观察到前胶原mRNA表达增加，而蛋白水平无明显
增高的另一个原因。