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肌性斜颈中基质金属蛋白酶I与Ⅲ型胶原的表达关系 |
马 达１，薛克修１，蔡新华２
（１．新乡医学院第三附属医院外科，河南 新乡 ４５３００３；２．新乡医学院中心实验室，河南 新乡 ４５３００３）
先天性肌性斜颈（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌｍｕｓｃｕｌａｒｔｏｒｔｉｃｏｌｌｉｓ，ＣＭＴ）是由于一侧胸锁乳突肌（ｓｔｅｒｎｏｃｌｅｉｄｏｍａｓｔｏｉｄ，ＳＣＭ）挛缩所致头部向患侧偏斜，并随患者年龄增长而逐渐引起面部及头颅畸形的一种常见病。该病以儿童为主，在婴幼儿发病率为０．４％～１．３％［１］。目前对其病因及发病机理尚无定论，故对该病的病因及发病机理仍需进一步探讨，为临床诊断及治疗该病提供确切的理论依据。本研究通过免疫组织化学技术观察ＣＭＴ胸锁乳突肌细胞外基质Ⅲ型胶原增生情况及基质金属蛋白酶（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ１，ＭＭＰ１）的表达情况，探讨Ⅲ型胶原增生与ＭＭＰ１表达的关系，进一步研究ＣＭＴ胸锁乳突肌纤维化的发生机制。
１ 材料与方法
１．１ 材料
收集新乡医学院三附院２００１年至２００６年间肌性斜颈手术标本共４９例，其中男２７例，女２２例，年龄６个月～１６岁，平均５．８岁。对照组７例非肌性斜颈小儿尸体胸锁乳突肌标本。主要试剂：鼠抗人Ⅲ型胶原单克隆抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司），山羊抗人ＭＭＰ１多克隆抗体（美国ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司），即用型ＳＡＢＣ免疫组化试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），即用型ＳＰ免疫组化试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），ＤＡＢ显色试盒（武汉博士德生物工程有限公司），所有标本经１０％中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，取横切面连续切片，片厚３～４μｍ，粘附于ＡＰＥＳ处理的载玻片上，置于５８℃～６０℃烤箱１ｈ以使切片紧密粘附。
１．２ 方法 Ｍａｓｓｏｎ三色胶原染色链霉卵白素过氧化物酶法方法按常规方法进行。免疫组化染色方法采用：（１）链酶亲和素生物素过氧化物酶法（ＳＡＢＣ法）；（２）链霉卵白素过氧化物酶法（ＳＰ法）。以上方法均按购买试剂厂家提供的说明进行。整个实验过程中，用ＰＢＳ代替一抗作阴性对照，用博士德公司和中杉公司提供的阳性片染色作阳性对照。
１．３ 结果观察 据Ｍａｓｓｏｎ三色胶原染色将所有ＣＭＴ标本分为２组：（１）肌肉型组：胶原纤维／（肌纤维＋胶原纤维）面积百分比＜５０％；（２）纤维型组：胶原纤维／（肌纤维＋胶原纤维）面积百分比＞５０％。据免疫组化染色，利用图像分析系统，测定Ⅲ型胶原和ＭＭＰ１阳性反应面积占全屏面积的百分比，以５个视野的均值为每张切片的阳性面积百分比。
１．４ 统计学处理 各组数据均采用均数±标准差（珋ｘ±ｓ）表示，应用ＳＰＳＳ１１．５软件包进行单因素方差分析及相关性分析，不同组别之间的两两比较，方差齐者采用ＬＳＤ法，方差不齐者采用Ｔａｍｈａｎｅ’ｓ法。Ｐ＜０．０５表示有显著性差异。
２ 结果
２．１ Ｍａｓｓｏｎ染色的观察 对照组中肌细胞间极少见蓝色胶原纤维，仅在肌束间及小血管附近可见少量的胶原纤维组织，肌细胞和肌束排列整齐规则。病变组中在肌束间及肌细胞周围均可见大量蓝色胶原纤维增生，肌细胞及肌束排列不规则，失去了正常的肌束结构，肌细胞有不同程度的萎缩，胶原增生严重的组织被大量蓝色胶原纤维占据，偶见红色的肌细胞。
２．２ ＣＭＴ的病理学分型 根据Ｍａｓｓｏｎ三色胶原染色，利用图像分析系统，对ＣＭＴ所有病变组标本进行病理学分型，其中肌肉型组２２例，纤维型组２７例，胶原纤维的面积百分比分别为（３１．０６±１２．０９）％、（６７．１９±１２．０７）％。
２．３ Ⅲ型胶原和ＭＭＰ１的免疫组化染色观察 Ⅲ型胶原在对照组中仅在肌束间质有少量表达，肌细胞间未见表达；在肌肉型组中Ⅲ型胶原的表达明显增加，在肌束间及肌细胞间均可见其表达；在纤维型组中Ⅲ型胶原较肌肉型组有更多的表达，大量的Ⅲ型胶原包绕残存的肌细胞。ＭＭＰ１在对照组中仅见间质小血管附近和部分肌细胞膜周边有少量表达；在肌肉型组中ＭＭＰ１在部分肌细胞周边可见浓集的表达，增生的间质亦有少量表达；在纤维型组中阳性表达极少见。ＭＭＰ１表达的量随着Ⅲ型胶原的增加而渐少。
２．４ Ⅲ型胶原和ＭＭＰ１的相对定量分析 Ⅲ型胶原在对照组表达极少，在肌肉型组和纤维型组中表达明显增加，２组与对照组相比均有显著性差异（Ｐ＜０．０１）。ＭＭＰ１在对照组中有少量的表达，在肌肉型组中表达量略有增加，但与对照组相比，其增高无统计学意义（Ｐ＞０．０５）；在纤维型组中表达极少，与对照组相比有统计学意义（Ｐ＜０．０５），与肌肉型组相比有显著性差异（Ｐ＜０．０１）。见表１。
２．５ 相关性分析 在肌性斜颈病变组中，Ⅲ型胶原的表达与ＭＭＰ１的表达呈负相关（ｒ＝－０．８４５，Ｐ＜０．０１），见图１。
３ 讨论
ＣＭＴ的基本病理变化是胸锁乳突肌间质增生和纤维化，间质增生主要是各种细胞成分和细胞外基质（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍａｔｒｉｘ，ＥＣＭ）的过度增殖，纤维化的发生则主要是因为胶原蛋白在ＥＣＭ的过度沉积，胶原蛋白是ＥＣＭ的主要成分，许多纤维化疾病的发生均与ＥＣＭ胶原蛋白的增生有关。胶原是一组多功能的蛋白质家族，是ＥＣＭ的结构蛋白质，根据胶原在体内的分布和功能特点分为间质胶原，基膜胶原，细胞外周胶原。在不同的组织器官中有不同的胶原分布，以适应其特定的功能需求。研究证实许多纤维化疾病的发生发展与ＥＣＭ主要是胶原的过度沉积相关，Ⅲ型胶原是主要的间质胶原，许多文献对肝纤维化程度的评分以及抗纤维化药物的治疗效果的评价均依赖于Ⅲ型胶原的表达量；在肺纤维化的研究中，早期病变中以Ⅲ型胶原增多明显。Ⅲ型胶原在肾间质纤维化的研究中也是热点［２］。在神经性膀胱逼尿肌的纤维化病理生理研究中发现膀胱逼尿肌间质中胶原纤维明显增加，以Ⅲ型胶原表达增加为主，是导致该肌发生纤维化和膀胱功能障碍的一个重要原因［３］。
本研究显示，ＣＭＴ之ＳＣＭ纤维化病变中，Ⅲ型胶原在对照组中仅在肌束间质有少量表达，肌细胞间未见表达；在肌肉型组中Ⅲ型胶原的表达明显增加，在肌束间及肌细胞间均可见其表达；在纤维型组中Ⅲ型胶原的表达较肌肉型组有更多的表达，大量的Ⅲ型胶原包绕残存的肌细胞。在增生的间质中，Ⅲ型胶原表达的部位具有一致性，该结果与薛克修等［４］的研究结果一致。分析文献资料［５－６］和本实验研究结果，作者认为胸锁乳突肌纤维化时，胶原纤维在间质病理性沉积可能与以下机制有关：（１）胶原的合成增加；（２）胶原交联结构的增加使胶原更加难以降解；（３）胶原的过度沉积导致胶原酶活性相应增加，而胶原酶活性的增加可以导致降解产物的增加，反馈引起异常的胶原再合成；（４）其他因素导致胶原酶活力下降或胶原酶特异性抑制因子等其他细胞因子抑制了胶原酶，使其降解胶原的能力下降。ＭＭＰｓ是参与ＥＣＭ降解的主要酶家族，目前已分离鉴别出２６个成员，编号分别是ＭＭＰ１～ＭＭＰ２６。ＭＭＰｓ根据其结构特征和底物特异性分为５个功能亚型［７］：（１）间质性胶原酶，主要包括ＭＭＰ１、ＭＭＰ８、ＭＭＰ１３和膜型１ＭＭＰ（ＭＴ１ＭＭＰ）；（２）明胶酶，包括明胶酶Ａ（ＭＭＰ２或称７２ｋＤⅣ型胶原酶）和明胶酶Ｂ（ＭＭＰ９或称９２ｋＤⅣ型胶原酶），主要降解基底膜重要成分－天然Ⅳ型胶原酶、明胶和Ⅴ型胶原等；（３）溶基质素，包括溶基质素溶基质素２（ＭＭＰ１０）、基质溶解素（ＭＭＰ７）和溶基质素３（ＭＭＰ１１），底物广泛，包括蛋白多糖、纤连蛋白、层粘连蛋白、明胶、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型胶原等；（４）膜型基质金属蛋白酶（ＭＴＭＭＰｓ）；（５）金属弹力蛋白酶。
ＭＭＰ１是人类主要的间质性胶原酶，主要降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原等间质成分，降解能力为Ⅲ型胶原＞Ⅰ型胶原＞Ⅱ型胶原。Ⅰ、Ⅲ型胶原是主要的间质性胶原，其分子中由３条肽链构成３股螺旋形的大分子即胶原域对蛋白酶的作用有一定的抗性，间质性胶原（人ＭＭＰ１，鼠ＭＭＰ１３）和噬中性胶原酶（ＭＭＰ８）能在α链上的特异性位点处裂解它们，从而使其他一些ＭＭＰ也能降解这些胶原。ＭＭＰ１作用于胶原纤维三螺旋结构某一部位中的氨基端３／４处水解ＧｌｙＩｌｅ或ＧｌｙＬｅｕ的肽键（残７７２７７３），从而使胶原分子的３条多肽链解旋。当胶原分子的３条肽链中某１条被胶原酶切断后，成为ＴＡＣ７５和ＴＢＣ２５片段，其余２条肽链发生变性，使整个胶原分子成为无规线圈（ｒａｎｄｏｍｃｏｉｌ），Ⅰ、Ⅲ型胶原变性后形成明胶，可被明胶酶降解，无规线圈易被中性蛋白酶和溶酶体酶等蛋白酶进一步降解。间质胶原酶和明胶酶协同作用于胶原的裂解。许多纤维化疾病的发生与Ⅲ型胶原的增生相关，探讨ＭＭＰ１在纤维化疾病发生发展中的作用及意义的研究报道很多。在肝纤维化疾病研究中ＭＭＰ１的具体表达情况文献报道尚不一致。一般认为随着肝纤维化程度的加重，ＭＭＰ１的表达和活性下降。Ｍｕｒａｅｋｉ等［８］利用硫氰酸钾和醋酸氨基苯汞变性去除酶抑制物后，测定各种肝病患者血清ＭＭＰ１的活性，结果显示血中ＭＭＰ１的活性与Ⅲ、Ⅳ型胶原呈显著负相关，表明在肝纤维化过程中ＭＭＰ１的活性是逐渐降低的，有力地证明了ＭＭＰ与肝纤维化发展有密切关系。而有研究认为胶原酶活性在肝纤维化时升高或肝损伤早期升高而随肝硬化的发展而下降，致使纤维化加重。还有研究显示肝纤维化发生、发展、形成过程中及肝硬变阶段ＭＭＰ１的基因表达无显著性差异变化，其酶原蛋白表达水平与基因表达水平一致，间质胶原酶在肝纤维化过程中的活性降低是导致Ⅰ、Ⅲ型胶原降解减少和过度沉积的主要原因，ＭＭＰ１的活性变化不是其基因或酶原蛋白表达水平变化造成的，而是与其抑制因子的抑制作用和酶原活化过程有关。Ｈｏｈｅｉｓｅｌ等［９］在结核性胸膜炎（ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓｐｌｅｕｒｉｔｉｓ，ＴＰ）纤维化机制的研究中发现，ＴＰ组患者胸腔积液中ＭＭＰ１的量显著高于对照组（来自于充血性心衰患者的胸腔积液），认为ＭＭＰ１参与了ＴＰ的纤维化病变。在肾间质纤维化机制的研究中，有学者利用免疫组化技术结合凝胶电泳发现ＭＭＰ１在肾间质纤维化模型组与对照组表达的量无显著性差异，而其降解胶原的活性却显著下降［１０］。
本研究显示，ＭＭＰ１在对照组中有少量的表达，在肌肉型组中表达稍有增加，但与对照组相比无统计学意义；在纤维型组中表达极少，与对照组相比有统计学意义，与肌肉型组相比有显著性差异。本研究还显示随着Ⅲ型胶原的增生，ＭＭＰ１的表达逐渐下降。ＭＭＰ１在肌肉型组表达与对照组相比无显著性差异，但在表达部位有所不同，ＭＭＰ１在正常对照组中表达较为均一，而肌肉型组中在肌细胞周边肌内膜内有较浓集的表达，这是否是由于胶原的增生导致ＭＭＰ１反应性增加，还有待于进一步研究。在纤维型组中ＭＭＰ１的表达明显降低，可能是由于胶原纤维的大量增生，代替了正常的肌组织，使得产生ＭＭＰ１的细胞大量减少，或者在ＳＣＭ纤维化后期大量致纤维因素的存在以及胶原酶抑制因子的大量增加而导致ＭＭＰ１表达和活性下降，Ⅲ型胶原过度沉积，ＳＣＭ纤维化程度逐渐加重。但其纤维化的具体机制，包括Ⅲ型胶原过度沉积以及ＭＭＰｓ的表达和活性的变化的原因还有待于进一步的研究。本研究提示，病变的胸锁乳突肌增生的胶原成分包含有Ⅲ型胶原蛋白，Ⅲ型胶原蛋白主要在胸锁乳突肌ＥＣＭ表达，且随着胸锁乳突肌纤维化程度的加重，Ⅲ型胶原蛋白的表达随之增加。Ⅲ型胶原在胸锁乳突肌ＥＣＭ的大量沉积可能是该肌纤维化挛缩的关键因素。在ＣＭＴ病变组中，随着Ⅲ型胶原表达的增加，间质胶原酶的表达呈逐渐下降趋势，其中的因果关系还有待于进一步研究。本实验的研究结果提示基质金属蛋白酶系统可能参与了ＳＣＭ的纤维化的发生，ＣＭＴ的发病机制可能与基质降解系统失平衡有一定的关系。
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