李　江1,武　芳1,黄　茂2,范焕芳3,安会波1,帅金凤1
(1.河北省儿童医院呼吸科;2.河北体育学院人体科学系;3.河北医科大学中医院肿瘤内科,石家庄050011)
　　肺纤维化(PF)是由多种原因引起的一类间质性疾病。肺组织细胞外基质成分在一定条件下过度沉积,最终形成PF。Ⅲ型胶原(Col Ⅲ)是PF组织中主要的细胞外基质成分之一,其水平高低可部分代表纤维化程度;层黏连蛋白(LN)在PF过程中增多,可致炎性细胞积聚于基底膜,损伤肺组织,直接导致PF发生。已有研究证明博莱霉素可导致小鼠PF,沉积的基质蛋白主要为Col Ⅰ、纤维连接蛋白,且Col Ⅰ/Col Ⅲ比例升高[1]。血清Ⅲ型前胶原及LN水平可作为评价肺间质病变活动性重要的无创性指标[2]。本实验采用博莱霉素A5复制PF动物模型,观察本模型血清及肺组织匀浆Col Ⅲ、LN等指标的变化,及光镜下病理形态学改变,探讨川芎嗪注射液对上述指标及病理形态学的影响,为其临床应用提供理论依据。材料与方法
一、材料　
1.实验动物:70只清洁级Wistar雄性大鼠,体质量150～170g,由河北医科大学实验动物中心提供。2.实验用药:博莱霉素A5针(BLM:8mg/支,天津太河制药有限公司生产,生产批号:050529);川芎嗪注射液(北京市永康药业有限公司生产,生产批号:05060601)。3.实验主要试剂及仪器:放射免疫试剂盒购于上海市军医学研究所;放射免疫计数器为中国科技大学实业总公司产品。
二、实验方法
　1.模型的分组、复制及标本留取:70只雄性大鼠除随机选取12只作为空白组外,余58只乙醚麻醉后,经颈正中切口分离气管,按5mg/kg(用9g/L盐水稀释为5mg/mL)气管内注入博莱霉素A5后,立即将动物直立并旋转,使药液在肺内分布均匀。注药过程中,由于操作失误导致大出血等原因死亡4只,余54只随机分为4组,模型组、川芎嗪大剂量组(大剂量组)各14只,川芎嗪中剂量组(中剂量组)、川芎嗪小剂量组(小剂量组)各13只。造模d2大、中、小剂量组开始每日腹腔注射川芎嗪注射液,剂量分别为250、150、40mg/(kg·d)。模型组腹腔注射中剂量组等体积9g/L盐水;空白组12只大鼠分离气管后,气管内按1mL/kg注入9g/L盐水,并于造模d2开始每天腹腔注射中剂量组等体积9g/L盐水。实验d14时每组随机取10只大鼠,股静脉采血,3000r/min离心15min,分离血清,-20℃冰箱保存备用。并每组处死2只大鼠,取肺左下叶置40g/L甲醛固定液中保存。至实验末即d28时将大鼠麻醉后留取血清,方法同前。并留取肺组织标本,右叶进行组织匀浆,左下叶行HE染色。2.血清学指标测定:采用放射免疫法测定d14、28血清Col Ⅲ及LN水平。3.肺组织指标测定:取适量肺组织放入冰冷9g/L盐水中漂洗除去血液,滤纸拭干秤其湿质量,适度剪碎后匀浆,测定Col Ⅲ及LN水平。4.肺组织病理学检查:取肺组织用40g/L甲醛固定,1周后进行常规石蜡包埋、切片(4μm)。行HE染色,观察病理形态学改变。
三、统计学处理
　采用SPSS11.5统计软件,数据均采用 x±s表示,采用单因素方差进行分析。
结　　果
一、各组大鼠死亡情况　至实验末模型组、大剂量组各死亡2只,中剂量组、小剂量组各死亡1只,其原因可能与博莱霉素A5的不良反应及气管切口处感染有关。
二、各组大鼠血清Col Ⅲ及LN水平　见表1。

四、病理组织学检查　1.大体观察:空白组双肺呈粉红色,表面光滑。模型组d14双肺颜色灰暗,质地较硬,有灰白色纤维素条和瘢痕,可见散在的灶状出血点;d28双肺体积缩小,硬度增加。川芎嗪大、中、小剂量组肺表面颜色略暗,硬度低于模型组,双肺体积缩小较模型组轻。其中以川芎嗪大剂量组硬化程度最轻。2.光镜观察:空白组大鼠的肺支气管、终末细支气管结构正常。模型组d14肺泡腔内可见少量炎性细胞渗出,肺泡壁增厚,纤维组织增生。d28PF的程度加重,纤维组织增生明显。川芎嗪大、中、小剂量组d14和d28纤维化病灶较模型组减少,纤维化程度较轻,其中以大剂量组病变减轻程度最为明显。
讨　　论
    PF是一组由多种病因引起的进行性纤维组织增生及细胞外基质的无规则过度沉积,最终导致肺间质弥散性纤维化的疾病。其发病与细胞外基质成分的过度沉积有密切关系。研究表明Col Ⅲ分布于肺间质,是肺间质纤维化组织中主要的细胞外基质成分之一,其水平高低可部分代表纤维化程度[2];LN广泛分布于基底膜的透明层,与胶原一起构成基底膜骨架。正常情况下,LN主要位于基底膜的内皮细胞及上皮细胞,血清中水平较低[3,4]。其增多表明上皮细胞损伤破坏,不断有新的细胞生成修复和增生,导致上皮增厚[5]。研究证明,血清LN和Col Ⅲ水平的升高即表明PF已发生和正在继续[6]。血清LN升高出现于PF早期阶段,先于肺内胶原沉积[7],可作为评价肺间质病变活动性重要的无创性指标[8]。研究表明,川芎嗪在增强PF患者机体抗病能力的同时,对局部炎性渗出有促进吸收作用[9],并对博莱霉素引起的脂质过氧化损伤有明显抑制作用[10],且能抑制博莱霉素A5诱导的PF大鼠肿瘤坏死因子的释放,降低肺组织钙水平及钙调素活性[11,12]。川芎嗪与氨溴索联用有协同作用[13]。为进一步研究川芎嗪的作用机制,并筛选其不同剂量的疗效,本研究进行了川芎嗪注射液对PF大鼠Ⅲ型胶原及LN干预作用的研究。结果表明,应用博莱霉素A5后血清及肺组织匀浆Col Ⅲ及LN水平明显增高,说明肺内细胞外基质的合成明显增加。予川芎嗪注射液后细胞外基质成分明显降低,提示川芎嗪通过降低细胞外基质水平而发挥治疗作用,推测其与复方鳖甲片及姜黄素有相同的作用机制[14,15]。不同剂量组研究表明,川芎嗪大剂量组效果更为明显,提示应用川芎嗪常规剂量治疗PF难以发挥较好疗效。本研究提示川芎嗪注射液能降低PF大鼠Col Ⅲ及LN的水平,减少细胞外基质沉积,这可能是其发挥治疗作用的机制之一,其具体作用机制有待于进一步研究。