1、 生化材料
鸡胰腺粉(冻干)
椰子油
腰果酚A
腰果酚B
生物质腰果酚磺酸盐表面活性剂
2、 特种树脂
红外增感树脂
耐溶剂型成膜树脂
热敏相转变树脂
KFP系列树脂
3、 响应型单体
2,4,6-三己氧基重氮苯5-苯甲酰基-4-羟基-2-甲氧基苯磺酸盐
红外增感染料
N-异丙基丙烯酰胺
4-磺酰苯基丙烯酰胺
N,N'-(1,4-亚苯基)双马来酰亚胺(对苯基双马来酰亚胺)
N-对羟苯基丙烯酰胺(AHPAA)
2-氯-1-甲酰-3-羟基亚甲基环己烯
1,1,2-三甲基苯并[e]吲哚
4、手性化合物
5、QINP1系列潜伏性环氧树脂固化剂
6、石材防水背胶(背网专用)
 
 
 
 

过量氟对大鼠体内、外I型胶原蛋白的影响

缪庆 徐茗 刘秉慈 尤宝荣 康宁
中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所,北京 100050
  骨组织是氟化物作用的主要靶组织,氟骨症中骨的基本改变为骨硬化、骨质疏松、骨软化和骨旁软组织骨化,但发病机理尚不清楚。骨组织由有机质和无机盐类(骨盐)组成,而骨盐中主要成分是无机钙和磷,占骨干重的65%~70%。有机基质是由成骨细胞分泌形成的,其成分主要为I型胶原(占90%)。自从20世纪70年代末印度学者Susheela提出“氟中毒的靶子学说”后[1],研究者开始关注过量氟对骨组织中胶原的影响。以往有研究对氟中毒骨组织胶原结构进行形态学观察或测定与胶原相关的某项生化指标[2]。本实验经饮水投氟复制大鼠氟中毒动物模型后,测定氟中毒大鼠血清中骨钙素含量,骨中无机质、胶原含量和胶原交联度;并体外分离大鼠颅骨成骨细胞,经NaF染毒后,用免疫组化方法观察过量氟对成骨细胞I型胶原表达水平的影响,为阐明过量氟对胶原的影响及氟中毒机理提供实验依据。
1 材料和方法
1. 1 主要试剂和仪器
    骨钙素放免分析试剂盒购于中国原子能科学研究院同位素研究所;II型胶原酶,透明质酸酶,购于Sigma;胰蛋白酶,胎牛血清,DMEM培养基,购于Gibco;其余试剂均为国产分析纯。主要仪器为:图像分析系统(ImagePro Plus,MediaCy berndtics,L.P.)。
1 .2 实验动物和方法
1 .2. 1 实验动物及染毒
   由中国医学科学院动物所提供的二级雄性Wistar大鼠(体重100~120g)40只,随机分为4组,每组10只,分别为:(1)给氟2个月组;(2)2个月对照组;(3)给氟1个月组;(4)1个月对照组。给氟组大鼠饮用NaF浓度为221mg L的氟水,对照组大鼠饮用蒸馏水。实验动物饲养相应时间后,断头处死大鼠,分别收集大鼠血清及经剥除结缔组织、洗净的长骨,以供各实验使用。
1.2. 2 成骨细胞分离、培养及染毒
   选取SD孕鼠(19~2天),乙醚麻醉后颈椎脱臼处死,75%乙醇消毒腹部,无菌条件下取出胎鼠。取胎鼠颅骨并仔细清除表面血迹及软组织,并在含有抗生素的D PBS溶液中浸泡10min。将骨片剪碎成糜状,37℃经II型胶原酶(1mg ml)及透明质酸酶(1mg ml)混合液的阶段性消化[3],每次20min,共消化6次。收集3~6批细胞,以5×105细胞数接种到含有DMEM培养基和10%胎牛血清的25ml培养瓶中,置37℃、5%CO2的培养箱中培养。待细胞长满后,用0. 25%的胰蛋白消化,以1×105细胞密度接种装有玻片的24孔培养板。2天后,实验组细胞给予0. 51 0mmol LNaF染毒48h,同时设立溶剂对照组(DMSO)。所有细胞用于免疫组化实验。
1. 2. 3 大鼠血清骨钙素(BGP)测定
   按骨钙素放射免疫分析试剂盒使用方法说明进行测定。
1 .2 .4 煅烧法测定骨中无机质含量
   取大鼠长骨,经60℃烤箱烘干(至重量无变化),称重为W干,然后放入600℃马福炉中烘烤6h(亦烤至重量无变化),剩余灰分称重为W灰,即为无机质重量。其中重量减轻部分即为有机质。分别计算无机质和有机质所占比例W灰 W干及(W干-W灰)/W干。
1 .2. 5 羟脯氨酸含量测定
   取大鼠长骨,于丙酮中脱脂后在103℃烤箱中烘干并磨碎。以分析天平称取40mg骨粉放于10ml安瓿中,加入2 .5ml6NHCl,封口后在118℃~120℃烤箱中水解12h,冷却后打开封口,将水解液稀释并中和至pH接近6,放置过夜。吸取稀释液200μl,放在试管中,加水至2ml,用氧化剂氯胺T(N-氯-对甲苯磺酰氨钠)将骨中羟脯氨酸氧化,再用过氯酸破坏多余氯胺T以终止氧化,最后使氧化物与对二甲基苯甲醛反应,生成紫红色进行比色,根据与标准试剂比较,计算其中羟脯氨酸含量,继而计算胶原含量。计算公式为样品光密度 标准液光密度×标准液稀释倍数×7 .46 称重的组织粉重。
1 .2. 6 胶原交联度分析
   大鼠长骨经生理盐水冲洗、EDTA脱钙、丙酮脱脂后以0 5mol L乙酸打制成匀浆,采用Chung和Miller限制性胃蛋白酶降解法提取胶原[4]。匀浆中加入胃蛋白酶(100mg g湿组织)搅拌过夜。离心(15000r min,30min)取上清。沉淀再用胃蛋白酶消化1次。合并两次离心所得的上清液,以0 .9mol LNaCl选择性沉淀胶原蛋白,纯化后的胶原供电泳分析。胶原蛋白SDS-PAGE电泳采用Laemmli和Studier的不连续电泳体系[5],制备3%成层胶及7 5%分离胶。胶原蛋白以4mg ml的浓度悬浮于样品缓冲液中,50℃变性30min,离心弃去不溶性沉淀,取上清进行电泳分析。电泳完毕后,0 .25%考马斯亮蓝染色2h,经10%甲醇和10%乙酸脱色后,用图像处理系统对电泳条带进行扫描,并计算α1(I)+α2(I)与β+γ条带积分面积比值。
1. 2. 7 生物素—抗生物素蛋白间接免疫组化观察
    成骨细胞I型胶原表达长有细胞的玻片取出后,温D Hanks液洗2次,5min 次。丙酮固定30s,室温干燥。滴加用PBS稀释的正常兔血清(1∶10),4℃孵育20min。滤纸吸去血清后,分别加用10%兔血清稀释的羊抗鼠1型胶原抗体(1∶50)和羊抗鼠MMP-1(1∶50),4℃孵育过夜。空白对照,以10%T兔血清代替第一抗体。冷PBS洗3次,5min 次。加入10%兔血清稀释的生物素化的兔抗山羊IgG(1∶99),4℃孵育1h。冷PBS洗3次,5min 次。ABC复合物(A∶B∶ABC=1∶1∶98,V V)37℃孵育30min。冷PBS洗4次,5min 次。滴加DAB显色液(5~10min),自来水终止反应。梯度酒精脱水、二甲苯透明后,树胶封片。
1. 2 .8 统计学处理
   以上结果以t检验进行统计学分析,所有数值均以( x±s)表示,P<0 05为差异显著。
2 结果
2. 1 血清骨钙素水平、骨中无机质百分含量及胶原蛋白含量测定
   本试验用血清骨钙素(BGP)反映成骨活性。由附表中可见,在投氟1个月后,投氟组大鼠较对照组略有升高,但无统计学意义(P>0 .05)。在投氟2个月后,投氟组BGP水平显著高于对照组(P<0. 05)。投氟2个月组大鼠骨中无机质百分含量也显著高于对照组(P<0 .05)。因脱水后骨组织仅由无机质和有机质组成,所以投氟2个月组大鼠有机质比例显著低于对照组。由比色法测定羟脯氨酸含量折算出的胶原蛋白含量结果可以看出,投氟1个月、2个月组大鼠骨胶原蛋白含量均显著低于同期对照组(P<0 .05)。


2 .2 胶原交联度分析
    图1所示为骨中I型胶原聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)图谱。胶原蛋白单链α链泳动于最前沿。由于I型胶原由二条α1(I)链及一条α2(I)链组成,故可在α链部位见较深的α1(I)带及较浅的α2(I)带。α链还可以缠绕形成二聚体及三聚体,在SDS PAGE电泳中,分别位于β带及γ带部位。如附表所示,经光密度扫描定量,发现投氟两个月组[α1(I)+α2(I)] [β+γ]显著高于对照组(P<0. 05)。
2 .3 成骨细胞I型胶原免疫组化结果
    对照组成骨细胞中有大量棕色颗粒,为成骨细胞所分泌I型胶原(图2A)。经0 5mmol L、1 0mmol LNaF染毒48h后,成骨细胞分泌胶原明显减少(图2,B,C)。



3 讨论
   不同程度的骨转换加速是慢性氟中毒的一种普遍现象,大量文献报道氟骨症病人呈高骨转换状态[5~7]。骨钙素(BGP)是骨组织中含量最为丰富的非胶原蛋白质,由成骨细胞合成并很快进入血液,是反映成骨细胞活性敏感而特异的指标。本实验中,大鼠在投氟2个月后,血清BGP含量显著高于对照组,说明在本实验氟浓度及作用时间下,可使氟组大鼠呈现氟中毒所具有的高骨转换状态。骨质由有机质和无机盐类(骨盐)组成。骨盐中主要成分是无机钙和磷,它们以高度结晶的羟磷灰石和无定形的磷酸氢钙的形式存在于骨内。氟进入人体后,可以氟磷灰石的形式大量沉积于骨组织中。我们通过煅烧法发现投氟2个月组大鼠长骨无机质百分含量显著高于对照组,提示一方面可能是骨中有大量氟沉积,而直接导致了无机质含量的升高;也可能是氟影响骨中有机质的主要成分胶原的合成与代谢,从而降低胶原的百分含量,间接升高了无机质的比例。
  骨中有机质的90%为I型胶原,I型胶原含量和结构的稳定对于维持骨的正常结构和功能有至关重要的作用。以往研究表明:一方面过量氟可干扰胶原的羟化过程,使骨胶原合成不完全;另一方面,氟中毒动物体内胶原交联不足,胶原分解加速。我们通过测定骨中羟脯氨酸含量,发现投氟1个月、2个月组大鼠骨胶原蛋白含量均显著低于同期对照组。同时发现过量氟可使大鼠骨中I型胶原的交联度下降,使胶原的三螺旋结构不稳定,加速胶原的分解;过量氟还可直接作用于产生I型胶原的细胞—成骨细胞,抑制成骨细胞I型胶原的分泌,导致骨中胶原蛋白含量下降。过量氟降低成骨细胞胶原蛋白合成可能是由于氟化物作为一种化学毒物,极易透过细胞膜攻击酶系统,抑制合成胶原蛋白的酶的活性,使胶原蛋白合成减少;也可能是影响胶原基因的转录,从mRNA水平抑制胶原蛋白的表达。而骨中有机质的主要成分I型胶原含量下降和稳定性发生改变,必将影响到骨组织的结构和力学特性,可能是导致氟骨症病人骨周软组织钙化、骨化的重要因素。因此,本研究为探索地氟病(氟骨症)发病机理提供了有意义的线索。

 
 
 
   
 
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