邓家德， 肖正华， 凌艳英， 冯泰宝
      （广州医学院附属广州市第一人民医院， 广东 广州 ５１０１８０）
   黄芪注射液是从中药黄芪中的精华提取而成， 主要成份为甙类、多糖、氨基 酸及多种微量元素， 其对免疫系统、血液 系统、心血管系统、肾功能及物质代谢等 具有不同程度的影响， 多种临床实验证 实其在防治感冒、预防支气管哮喘、治疗 胃及十二指肠溃疡 ／萎缩性胃炎 ／慢性乙 型肝炎等取得了较好的效果［１］； 本研究在 体外用黄芪作用于糖尿病足溃疡处成纤维细胞， 旨在观察黄芪对糖尿病足溃疡 处成纤维细胞分泌Ⅰ、 型胶原的影响。      
 １ 材料与方法
 １．１ 引物序列 Ⅰ型胶原正 ／负链 序 列 分 别 为 ： ５＇ － ＧＴＴ ＣＧＴ ＧＧＴ ＴＣＴ ＣＡＧ ＧＧＴ ＡＧ－ ３＇ 和 ５＇－ ＴＴＧ ＴＣＧ ＴＡＧ  ＣＡＧ ＧＣＴ ＴＣＴ ＴＴ－ ３＇； Ⅲ型胶原正 ／负 链序列分别为： ５＇－ ＣＧＡ ＧＧＴ ＡＡＣ ＡＧＡ ＧＧＴ ＧＡＡ ＡＧＡ － ３＇ 和 ５＇ － ＡＡＣ ＣＣＡＧＴＡ ＴＴＣ ＴＣＣ ＡＧＴ ＣＴＴ－ ３＇； ＧＡＰＤＨ 引 物正 ／负链序列： ５＇－ ＴＧＣ ＴＴＴ ＣＣＧ ＴＣＧＴＡＴ ＣＣＡ－ ３＇ 和 ５＇－ ＣＡＣ ＣＧＴ ＣＡＧ ＴＡＧ  ＣＣＣ ＡＧＴ－ ３＇， 扩 增 片 段 大 小 分 别 为  ３４８ｂｐ、            ３４９ｂｐ 和 ２２１ｂｐ。
             １．２ 材料与主要试剂 黄芪注射液
    （ 成 都 地 奥 公 司 ）， Ｔｒｉｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ （ＧｉＢｃｏ 公 司 ），   ｃＤＮＡ 第一链合成 Ｋｉｔ （上海生物工程公     司）、ｄＮＴＰ、Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶、引物合成  （ 上 海 生 物 工 程 公 司 ）， ＤＥＰＣ、ＤＮＡ  ｍａｒｋｅｒ（ 华美生物公司）， 胎牛血清（ 四季 清公司）， 异丙醇等常用化学试剂（Ｓｉｇｍａ
公司或国产分析纯）； Ⅰ、Ⅲ型胶原放射
    免疫检测试剂盒（上海海研所）。
１．３ 方法
１．３．１ 成纤维细胞培养 取溃疡创面 组织， 经 ０．０１ｍｇ／Ｌ新洁尔灭浸泡 １０ｍｉｎ 后生理盐水漂洗， 剪成 １ｍｍ３大小， 贴壁 ２ｈ 后将组织块培养于含 １００ｍｌ／Ｌ胎牛血清的ＤＭＥＭ培养基中， 培养条件为 ３７℃， 体积  分数为 ５％ＣＯ２， 细胞生长至对数生长期后，  将细胞悬液调整至 １×   １０７／Ｌ， 移入 ２４ 孔板中培养， 待细胞贴壁后用含／未含 ２０ｇ／Ｌ黄芪的培养液进行培养， 待瓶底长满细胞后，以 ２．５ｍｇ／Ｌ胰酶消化传代， 培养 ６ 天后， 收     集细胞作相应检测。
 １．３．２ 半定量 ＲＴ－ ＰＣＲ 检测Ⅰ、Ⅲ型胶原 ｍＲＮＡ 表达 细胞 ＲＮＡ 的提取按 Ｔｒｉｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ 试剂盒说明书进行； 用ｃＤＮＡ 第一链合成 Ｋｉｔ 将Ⅰ、Ⅲ型胶原ＲＮＡ 逆转录为 ｃＤＮＡ 按试剂盒说明书进行； ＰＣＲ 反应扩增Ⅰ、Ⅲ型胶原 ｍＲＮＡ－ＰＣＲ 反 应 体 系 （５０μｌ）： １０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（５．０μｌ）， ２５ｍＭＭｇｄ２ （３．０μｌ）， ４ ×ｄＮＴＰ（３．０μｌ）， Ⅰ、Ⅲ型胶原 ２０ｕＭ 引物正链和负链（１．５μｌ）， ②ＧＡＰＤＨ２０ｕＭ 引物正链 ／负 链 （０．７５μｌ）， ｃＤＮＡ（２．０μｌ）， ５Ｕ／μｌＴａｇ（０．８μｌ）， Ｈ２Ｏ （３３．２μｌ）。半定量 ＲＴ－ ＰＣＲ反应 （ 同一管内进行）； ＰＣＲ 反应条件： Ⅰ、Ⅲ型胶原 ｍＲＮＡ 扩增： 先加Ⅰ／Ⅲ型胶原和 ＧＡＰＤＨ 引物（１．５μｌ＋１．５μｌ）， ９５℃预 变 性 ５ｍｉｎ， ９４℃变 性 ３０Ｓ， ６０℃退 火１ｍｉｎ， ６８℃延 伸 ２ｍｉｎ， ３０ｃｙｃｌｅ； ＰＣＲ 产 物各取 １０μｌ 用 １．５ｇ／Ｌ 琼脂糖凝胶进行电泳， ＥＢ 染色观察。一次性成像系统照相，各条带的光密度值用彩色图像摄录输入 仪（ 型号： ＪＶＣｋｙ－ Ｆ３０Ｂ ３－ ＣＣＤ） 输入， 德 国 ＫＯＮＴＲＯＮ ＩＢＡＳ ２．０ 全自动图像分 析系统进行分析， 分析结果用Ⅰ／Ⅲ型胶 原 ／ＧＡＰＤＨ 计算得到Ⅰ、Ⅲ型胶原 ｍＲ－ＮＡ 表达的半定量结果。
 １．３．３ 体外合成Ⅰ、Ⅲ型胶原含量的测定 留取用含 ／未含 ２０ｇ／Ｌ 黄芪的培养液进行细胞培养后每次换液的上清液， 用全自动 γ计数仪检测Ⅰ、Ⅲ型胶原含量， 操作按试剂盒说明书进行。
 １．４ 统计学方法 计量资料用ｘˉｓ     ±表示， 差异比较采用配对 ｔ 检验。
 ２ 结 果
 ２．１ 含／未含黄芪的培养液培养后 的成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原 ｍＲＮＡ 表达 ＲＴ－ ＰＣＲ 结果分析 将用含 ／未含黄芪 的培养液培养后的成纤维细胞 ＲＮＡ 经 逆转录后与内参照 ＧＡＰＤＨ 于同一条件下同时扩增， 其扩增产物强度经电泳后 图像分析， 结果表明， 用含黄芪的培养液 进行培养后的成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原 ｍＲＮＡ 表达均明显高于未含黄芪的培养 液进行培养后的成纤维细胞的表达， 结 果经 ｔ 检验比较， 差异有统计学意义（Ｐ＜ ０．０５）， 具体结果见表 １／图 １、图 ２。

３ 讨 论
    糖尿病足溃疡较普通伤口难以愈合的原因目前尚不清楚。因而缺乏有效的治疗手段来减少致残 ／致死的发生［２］。正常的伤口修复过程包括炎症、增生和修复三个阶段， 细胞在这些阶段中发生了系列变化， 其中成纤维细胞的变化尤其令人注目。在此过程中不仅参与新生毛细血管的形成， 而且形成胶原、酸性粘多糖及其他细胞外基质， 起着关键作用［３］；
     人体各种组织主要由细胞与细胞外 间质两大类成份组成， 以往人们对于构  成组织的细胞较为注重， 近来细胞外基质越来越引起研究者的注意； 胶原是细胞外基质的主要成份， 分布于多种组织中， 其中Ⅰ、Ⅲ型胶原是人体组织中比例最大的胶原类型， 且主要分布于皮肤中，它们由纤维母细胞合成［４］。
     我们过去在黄芪治疗糖尿病足溃疡的临床及实验中发现黄芪能加速糖尿病足溃疡的愈合［５］。同时在体外用黄芪作用于糖尿病足溃疡处成纤维细胞， 从细胞学、蛋白及分子水平观察细胞形态、增殖特性、细胞周期， 免疫组织化学方法检测ＰＣＮＡ 蛋白表达， 半定量 ＲＴ－ ＰＣＲ 检测Ｐ２１ＷＡＦｌｍＲＮＡ 的表达。黄芪作用后成纤维细胞形态趋于正常， 细胞倍增时间缩短， Ｇ１ 期阻滞率降低， ＰＣＮＡ 蛋白表达增高， Ｐ２１ＷＡＦ１ｍＲＮＡ 的表达上调将近４ 倍， 证实黄芪可促进糖尿病足溃疡处成纤维细胞形态修复及细胞增殖［６］。
    胶原的合成首先通过 ｍＲＮＡ 转录核内特定 ＤＮＡ， 在内质网核糖体上经 ｔＲＮＡ翻译装配成前 α－ 链， 同时进行糖化和羟化， 然后进入内质网腔内结合成前胶原蛋白分子， 再由运输小泡和中间小管运 送到高尔基体囊泡中加工， 通过泡吐和直接分泌到细胞外。本实验用含 ／未含黄芪的培养液培养糖尿病足溃疡处成纤维细胞， 结果用含黄芪的培养液培养的糖尿病足溃疡处成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原ｍＲＮＡ 表达及培养液后培养液中Ⅰ、Ⅲ型胶原含量均高于未含黄芪的， 且差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）， 说明黄芪能通过上调成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原 ｍＲＮＡ表达， 而使Ⅰ、Ⅲ型胶原分泌量增高， 有利于伤口肉芽组织的形成， 加速伤口的 愈合。证实黄芪对糖尿病足溃疡处成纤维细胞功能的恢复有一定的影响。