刘凯 张选奋 张瑾 曹明华 钟琳 樊勇
创面愈合和瘢痕形成是新血管形成的结果,内皮细胞增殖和合成细胞外基质是血管形成的基础[1]。当归提取物通过促进胃上皮细胞移动和增殖而促进溃疡愈合[2,3],通过清除自由基和升高ＰＧＩ2和ｃＡＭＰ抑制主动脉平滑肌细胞增殖抑制血管生成[4],减少前胶原Ⅲ的合成起抗ＣＣｌ4引起的实验性肝纤维化[5,6],已被用于增生性瘢痕的试验性治疗[7]。然而,当归挥发油(ａｎｇｅｌｉｃａｎａｐｈｔｈａ,ＡＮ)对人脐静脉内皮细胞(ｈｕｍａｎｕｍｂｉｌｉｃａｌｖｅｉｎｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌ,ＨＵＶＥＣ)增殖、凋亡和胶原合成的影响鲜见报道,我们进行了如下检测。
1 材料和方法
1.1 材料
1. 1. 1 主要试剂 ＤＭＥＭ细胞培养基(Ｇｉｂｃｏ公司)、胎牛血清(Ｈｙｃｌｏｎｅ公司)、兔抗人Ⅷ因子相关抗原多克隆抗体(ＳａｎｔａＣｒｕｚ)、Ⅲ型前胶原氨端肽(ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎⅢＮ ｔｅｒｍｉｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ,ＰⅢＮＰ)放射免疫分析试剂盒(北方生物技术研究所)。
1 .1 .2 主要仪器 倒置相差显微镜(德国,Ｌｅｉｃａ)、ＣＯ2恒温孵育箱(美国,ＲＥＶＣＯ)、流式细胞仪(美国ＢＤ公司,ＦＡＣＳｃａｎ),酶标仪(奥地利,Ｓｕｎｒｉｓｅ)。
1 .2 方法
1 .2 .1 细胞培养及鉴定 细胞培养参照文献[8]方法。用胶原酶灌流消化法分离新鲜脐带的ＨＵＶＥＣ,在含20%胎牛血清(ＦＢＳ)、青霉素105Ｕ Ｌ、链霉素100ｍｇ Ｌ的ＤＭＥＭ、37℃5%ＣＯ2饱和湿度培养。细胞融合后,胰酶消化传代,实验用3～5代细胞。Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学染色阳性[9]和倒置显微镜下呈鹅卵石状排列等鉴定为内皮细胞。
1. 2. 2 药物制备及实验分组 采用水蒸气蒸馏法提取当归挥发油。当归药材3000ｇ,粉碎,过3号筛。连续蒸馏8ｈ,收集到浓度为1. 2ｇ ｍｌ的挥发油(11 .958ｇ 9. 98ｍｌ)。铝箔密封4℃保存。1ｍｌＡＮ用2ｍｌ1%吐温 80助溶,初始浓度为400ｍｇ ｍｌ。用ＤＭＥＭ配成ＡＮ终浓度为1、4、16ｍｇ Ｌ的溶液。实验分为ＡＮ组和对照组,ＡＮ组分别采用上述3种浓度的ＡＮ,对照组用含相应浓度吐温 80的ＤＭＥＭ培养液。
1. 2. 3 细胞增殖检测 用噻唑蓝染色法检测。内皮细胞(1×105 ｍｌ)于96孔板常规培养24ｈ后,ＡＮ刺激48ｈ,每孔加5ｍｇ ｍｌ噻唑蓝20μｌ孵育4ｈ,弃去上清液,加入ＤＭＳＯ150μｌ,振荡10ｍｉｎ。酶标仪上490ｎｍ下测吸光度Ａ值,每组8孔(ｎ=8),重复测量2次。促增殖率=(当归组Ａ值-对照组Ａ值) (对照组Ａ值-培养液组Ａ值)×100%。
1 .2 .4 细胞周期及凋亡检测 用碘化丙啶(ＰＩ)染色后流式细胞检测。内皮细胞常规培养24ｈ后,加入ＡＮ培养48ｈ。常规消化离心细胞,ＰＢＳ洗3次,预冷的70%乙醇4℃固定过夜,ＲＮＡ酶37℃消化30ｍｉｎ,ＰＩ染色。流式细胞仪检测细胞ＤＮＡ,每个样品至少测定10000个细胞,重复2次。
1 .2. 5 胶原合成测定 放射免疫法检测培养上清液中ＰⅢＮＰ。细胞常规培养24ｈ,加入ＡＮ培养12、24、48ｈ后吸取上清液,-20℃保存,2周内检测。检测时,培养上清液100μｌ中加入兔ＰⅢＮＰ抗体200μｌ,4℃放置20ｈ,加125Ｉ ＰⅢＮＰ100μｌ,充分摇匀,4℃放置4ｈ,加驴抗兔免疫分离剂500μｌ,室温放置20ｍｉｎ,4000ｒ ｍｉｎ离心30ｍｉｎ,吸弃上清液,γ计数器测定放射活性。重复测定2次,取平均值。1 2 6 统计学处理 数据用均数±标准差表示,ＳＰＳＳ10 0软件包中单因素方差处理。Ｐ<0 05为差异有统计学意义。
2 结果
2 .1 不同浓度的ＡＮ对ＨＵＶＥＣ增殖的影响
ＡＮ在1、4ｍｇ Ｌ时促进ＨＵＶＥＣ增殖,4ｍｇ Ｌ时达最大效果(Ｐ<0 01),16ｍｇ Ｌ时降低。ＡＮ在16ｍｇ Ｌ的促增殖作用明显低于4ｍｇ Ｌ(Ｐ<0 05,表1)。
2. 2 不同浓度的ＡＮ对ＨＵＶＥＣ周期和凋亡的影响
≤4ｍｇ Ｌ的ＡＮ减少Ｇ0 Ｇ1期细胞,显著增加Ｓ期细胞(Ｐ<0 05),凋亡率降低。16ｍｇ Ｌ的ＡＮ明显增加Ｇ0 Ｇ1期细胞,减少Ｓ期细胞(Ｐ<0 05),凋亡率增高(Ｐ<0 05,表2)。
2 .3 不同浓度的ＡＮ对ＨＵＶＥＣ胶原合成影响
随ＡＮ浓度增加和作用时间延长,ＡＮ降低ＨＵＶＥＣ培养上清液的ＰⅢＮＰ的浓度(Ｐ<0 05或0 01,表3)。
3 讨论
当归活性成分包括主要起抑制效应的挥发油和兴奋作用的水溶性两部分[10,11]。我们发现,ＡＮ对ＨＵＶＥＣ增殖具有双向调节作用:≤4ｍｇ Ｌ时促进细胞增殖,减少Ｇ0 Ｇ1期细胞而显著增加Ｓ期细胞,并降低凋亡率;≥16ｍｇ Ｌ时抑制增殖,显著增加Ｇ0 Ｇ1期细胞而减少Ｓ期细胞,并增加凋亡率。这种双向性调节作用的机制尚需进一步研究。
以往的研究发现,当归注射液可抑制成纤维细胞合成胶原[12],拮抗大鼠气管内注入博莱霉素诱导的肺纤维化[13],并显著降低四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化模型的血清Ⅲ型前胶原水平[6]。我们发现ＡＮ呈剂量和时间依赖性地抑制ＨＵＶＥＣ合成胶原,均支持ＡＮ可用于防治瘢痕增生。然而,ＡＮ的抑制作用的机制尚不清楚,可能与其化学成分有关,ＡＮ的主要成分为藁本内酯和丁烯基酞内酯均有抑制胶原合成的作用[14]。Ⅲ型前胶原氨端肽(ＰⅢＮＰ)是Ⅲ型前胶原在细胞外沉积前经氨基端肽酶裂解所产生的氨基端多肽,分子较小可进入血液循环,可通过检测血液中ＰⅢＮＰ的含量来判断体内胶原合成情况,已作为判定肝纤维化程度的指标[15]。创伤愈合和瘢痕增生过程中存在较高的胶原的合成和分解,因此,ＰⅢＮＰ水平可用作检测Ⅲ型胶原合成情况。抑制内皮细胞增殖和合成胶原可抑制血管生成而抑制血管形成,可有效抑制瘢痕形成。但是,抑制血管生成可延缓创伤愈合并导致瘢痕增生。临床急需既能促进创伤愈合又能抑制瘢痕过度增生的药物。≤4ｍｇ ＬＡＮ促进ＨＵＶＥＣ增殖可增加血管形成,促进创面愈合,而≥16ｍｇ Ｌ时诱导ＨＵＶＥＣ细胞凋亡,能减少血管形成,且ＡＮ可抑制ＨＵＶＥＣ胶原合成,因此,ＡＮ具有这种双向调节效应,可促进创面愈合并防止瘢痕过度增生。
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