*宋关斌1,2Δ 秦 建1 严润彬1 申晓东1罗 庆1 蔡绍皙1 孙才新2
1(重庆大学生物工程学院生物力学及组织工程教育部重点实验室,重庆 400044)
2(重庆大学电气工程学院高电压及电工新技术教育部重点实验室,重庆 400044)
1 前 言
肿瘤作为一种周期失控的恶性疾病,严重地危害人类健康,其恶性表现之一就是它的侵袭转移性,这是引起肿瘤晚期恶化,导致死亡的直接原因[1]。无论对临床医学或是基础理论来说,研究并阐明肿瘤细胞侵袭和转移的机制都是头等重大的课题。恶性肿瘤常见的转移途径主要有淋巴道转移、血道转移和种植性转移,肿瘤经血道转移通常需经历浸润性生长→侵蚀基底膜→穿透内皮细胞→血道运输→靶器官微血管附着→穿出内皮及在靶组织形成转移灶等,这是一个十分复杂的多阶段连续过程,其间存在着复杂的细胞生物学和细胞流变学机制[2]。原发性肝癌(Hepatocellularcarcinomacells,HCC)是世界上十大常见癌症之一,自20世纪90年代以来其发病率已上升为恶性肿瘤的第二位。近年来尽管肝癌的诊断、治疗取得了较大进展,但关于肝癌细胞的侵袭转移机制至今尚未完全阐明。肝癌细胞与胞外基质的黏附特性和肝癌的侵袭转移密切相关,胶原蛋白I(collagenI)是肝脏Disse间隙主要成分之一,也是肝癌细胞侵袭转移过程中必须穿过的重要屏障[3]。本文将细胞力学和细胞生物学有机结合,应用先进的微管吸吮技术(Micropipetteaspirationtechnique)从细胞周期的角度研究肝癌细胞与I型胶原裱衬表面的黏附力学特征及其与细胞周期的关系,为全面认识肝癌的转移机理提供定量的细胞力学依据。
2 材料和方法
2.1 细胞培养
大鼠肝癌细胞株(CBRH-7919)购于中国科学院上海细胞生物学研究所,在本院细胞培养室以RPMI-1640+10%小牛血清(Hyclone公司)按常规方法传代培养。
2.2 肝癌细胞的同步化及检测[4,5]
G1期细胞采取胸腺嘧啶脱氧核苷(重庆化学试剂公司)和秋水仙碱(Serva公司)顺序阻断后释放培养的方法获得,S期肝癌细胞采用胸腺嘧啶脱氧核苷双阻断后释放培养获得。将同步后收集固定的细胞分别以pH7.4PBS液清洗,碘化丙啶(Propid-lumIodide,PI)染色30min,根据周期时相细胞DNA含量不同,利用流式细胞仪(美国BD公司)检测,进行细胞周期分析。
2.3 Chamber玻璃底面的裱衬
自制以玻璃为底面的Chamber(圆形小室)。按文献[6]的方法对Chamber底面进行裱衬:先用2μg/ml多聚赖氨酸(PDL,Sigma公司)裱衬,用于桥接胶原蛋白I与底面,在此基础上将不同浓度胶原蛋白I(Sigma公司)裱衬Chamber底面,最后用牛血清白蛋白(BSA,华美公司)裱衬,裱衬好的Chamber置4℃冰箱中保存备用(24h内使用)。
2.4 肝癌细胞与CollagenI黏附力测量
采用微管吸吮实验技术[7],在裱衬好的Chamber中加入适量的CBRH-7919肝癌细胞,相互作用30min后开始实验:在显微镜下确定待测细胞后,调节压力系统使压力为零(零压状态),控制显微操作手将微管管口轻轻接触到待测细胞(见图1a),通过压力控制系统对微管施加一阶跃负压(ΔP),细胞会发生变形而有小部份细胞膜被吸入微管(见图1b),通过显微操作手缓慢水平拉动微管(见图1c),调节负压的大小,直至将待测肝癌细胞从黏附的Chamber底面上刚好拉脱为止(见图1d),此时的负压值即为将待测细胞拉掉的临界压力值。
2.5 黏附力的计算及数据处理
定义肝癌细胞与胞外基质间黏附力(F)的计算公式为[8]:
式中:RP为微管内半径(本实验中微管内半径在2.5～3.0μm之间);ΔP为吸吮负压;θ为微管与平面夹角。在实验过程中,控制微管与水平面的夹角θ在10左右,则cosθ≈cos10°=0.985≈1,这样黏附力F的计算公式可简化为:
各组细胞黏附力值以x±s表示,进行两样本均值的t检验。
3 结 果
3.1 大鼠肝癌细胞(CBRH-7919)的同步化
经流式细胞仪检测,未同步处理的CBRH-7919肝癌细胞组(对照组)各周期时相的百分比为Go/G1期40.07%、G2/M期22.76%、S期37.18%,采用胸腺嘧啶脱氧核苷、秋水仙碱顺序阻断和胸腺嘧啶脱氧核苷双阻断后释放培养的方法同步肝癌细胞,G1期和S期平均同步率分别为74.09%和98.29%(见表1),表明应用胸腺嘧啶脱氧核苷和秋水仙碱能较好地将肝癌细胞同步于G1期和S期,可满足后续微管实验的要求。
3.2 肝癌细胞与胶原I的特异黏附
在用胶原I裱衬好的chamber中加入足量的胶原I的单克隆抗体(Sigma公司),30分钟后再加入肝癌细胞做黏附力测量,同时以非特异抗体(Sigma公司)做比较,发现在该实验条件下肝癌细胞主要是与胶原I发生黏附的(结果见表2)。
3.3 肝癌细胞与胶原I黏附的时间依赖性
对于肝癌细胞与胶原I黏附的时间依赖性,我们通过在2h内连续测量完成所有实验,然后将其分为四个时间段考察,如表3所示。
3.4 肝癌细胞与胶原I黏附的浓度依赖性
应用微管吸吮技术研究了大鼠肝癌细胞与胶原I的黏附力与胶原浓度的关系,结果见图2。在研究的胶原剂量范围内,随着裱衬胶原浓度的升高,肝癌细胞与胶原I的黏附力也增大。
3.5 肝癌细胞与胶原I黏附的周期依赖性
测定未同步化、G1期和S期肝癌细胞与胶原I的黏附力,结果见图3。S期肝癌细胞与胶原I的黏附力比G1期相应值明显降低(P<0.001),与未同步化实验组比较也明显降低(P<0.001)。
4 讨 论
4.1 肝癌细胞(CBRH-7919)的周期同步
细胞同步化是研究细胞周期各时相形态、结构、功能等相关性质差异的重要方法。体外培养细胞同步化方法有多种,可根据细胞来源不同选用不同的方法[9]。本文通过胸腺嘧啶脱氧核苷和秋水仙碱顺序阻断法以及胸腺嘧啶脱氧核苷双阻断法对该细胞进行同步,其G1期和S期的同步率分别为74.09%和90.39%,这一同步结果基本能满足后续微管吸吮实验的要求。但研究发现G1期的同步率低于S期的同步率,其原因可能与同步方法的差异有关。G1期细胞的同步是采用胸腺嘧啶脱氧核苷和秋水仙碱顺序阻断于M中期,撤去药物后收集中期细胞培养使之进入G1期。在收集M中期细胞时,采取摇晃振荡细胞培养瓶,使M中期细胞脱落,这样的操作影响因素较多,可能会有其它非中期细胞脱落,因此导致G1期细胞的百分比偏低。
4.2 肝癌细胞与胞外基质的黏附模型
已有文献报道应用微管吸吮技术对细胞在玻璃底面、PDL裱衬底面、PDL+胶原裱衬底面、PDL+胶原+BSA裱衬底面几种情况下的黏附力学特性进行了方法学上的探讨[10],表明细胞的黏附主要来源于与胶原的相互作用。PDL主要用于桥接胶原与玻璃底面,使胶原牢固地与底面黏附;裱衬的BSA只是起填空作用。本文在此裱衬方法的基础上,进一步用胶原I的单抗做阻断实验,并与非特异单抗比较,证明肝癌细胞在该条件下的黏附主要来源于胶原I,因此本实验所采用的实验方法和建立的黏附模型是可行的。
4.3 肝癌细胞与胶原I裱衬表面的黏附特性
肿瘤细胞与胞外基质成分的黏附是肿瘤细胞侵袭转移过程的主要生化事件之一。肿瘤细胞可产生细胞外基质,反过来又受其制约,形成细胞动力学交互作用。细胞外基质成份通过相应的受体黏附分子,对细胞黏附、增生、分化、细胞骨架组装、细胞运动和水解酶释放有广泛的调节作用。实验发现,大鼠肝癌细胞CBRH-7919与胶原I裱衬表面的黏附力随着黏附时间的变化而变化,黏附力在30～60min内迅速增长,60min之后维持在较稳定的水平,即150(F×10-10N)左右。这可能是由于肝癌细胞上黏附分子表达呈现时间效应,从而使其黏附行为趋于稳定。本实验结果发现,肝癌细胞与I型胶原的黏附力在研究剂量范围内随着胶原浓度的增加而增大,表现出明显的浓度依赖关系,这和肝癌细胞与IV型胶原黏附作用的报道结果基本一致[8]。王芳等[11]对恶性肿瘤细胞侵袭不同阶段基底膜的变化作了研究,发现随着肿瘤的生长,基底膜中IV型胶原和层粘连蛋白的含量均增加,但随着肿瘤的转移又出现基底膜缺损的现象,并指出胶原和层粘连蛋白的增加不仅来自肿瘤细胞自身的分泌,而且肿瘤细胞可能会促使其他细胞进行分泌。所以胞外基质成分浓度的增加在肿瘤细胞与胞外基质作用中可能起着重要作用,使肿瘤细胞产生趋化性,并定向活跃运动,同时提供较强的黏附力和粘着位点。本实验中,G1期肝癌细胞与I型胶原的黏附力比S期相应值明显增大(P<0.001)。Liotta等[12]发现侵袭性的人乳腺癌细胞膜具有比良性乳腺损伤的细胞膜大50倍的层粘连蛋白结合能力。纤维粘连蛋白在改善肿瘤细胞的铺展及促进S/G2期DNA的合成及增殖方面发挥较大作用,而层粘连蛋白则对肿瘤细胞的黏附及运动游走所起作用更大。从细胞周期角度讲,M期细胞表达的纤维粘连蛋白受体最少,因此G1期和S期肝癌细胞与胶原I的黏附力差异可能就反映了肝癌细胞表面黏附分子受体分布的周期差异,从而使G1期肝癌细胞表现出一种黏附的活跃状态,反映在肝癌细胞的侵袭和转移过程中,推测G1期肝癌细胞比S期细胞可能更易于与间质组织相互作用。
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